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MESA, PESA, TESE e TESA


Várias técnicas de coleta são indicadas em casos de azoospermia: aspiração microcirúrgica de espermatozóides do epidídimo (MESA), aspiração percutânea dos espermatozóides do epidídimo (PESA), biópsia e extração dos espermatozóides do testículo (TESE), e aspiração percutânea dos espermatozóides do testículo (TESA). O método de escolha para a coleta dos espermatozóides depende de vários fatores (facilidades para criopreservação, características individuais), especialmente da experiência do cirurgião com essas técnicas. A MESA é uma técnica invasiva, em princípio indicada para os casos em que existe a possibilidade de uma correção microcirúrgica da azoospermia. Na impossibilidade da realização de uma vasoepidídimostomia, a MESA propicia amostra em suficiente quantidade para o processo de criopreservação.

Em geral, quando a azoospermia obstrutiva é causada por vasectomia (causa mais freqüente) o tratamento de escolha é a reversão de vasectomia. A taxa de sucesso da reversão é de 50%. Por outro lado, em caso de obstrução do epidídimo por infecções (Chlamydia trachomatis species ou Neisseria gonorrhea), o tratamento cirúrgico possui resultados que não excedem 20% de gestações. Nessa situação, a coleta dos espermatozóides do epidídimo com subseqüente ICSI ( Intracitoplasmatic Sperm Injection ) apresenta resultados satisfatórios. Em linhas gerais, não há diferença entre as taxas de fertilização dos óvulos e de gravidez após ICSI realizado com um espermatozóide criopreservado ou a fresco. Nos homens nos quais a reconstrução não está indicada, a MESA poderá ser realizada com coleta de grande número de espermatozóides para criopreservação, entretanto opções menos invasiva como a PESA seria mais indicada, pois tal procedimento usa anestesia local e o paciente estaria dispensado logo após a coleta. Vários pesquisadores acreditam que não há diferença na recuperação de espermatozoides por MESA ou PESA, que se referem ao prognóstico após o ICSI é semelhante nos casos de azoospermia obstrutiva com espermatozóides criopreservados colhidos com PESA ou MESA. Embora a PESA possa ser executada várias vezes no mesmo epidídimo, entretanto sua principal desvantagem é uma possível fibrose local. Os resultados com PESA seguido com ICSI são satisfatórios variando fundamentalmente em função da idade das pacientes.

A biópsia testicular aberta (TESE) tem sido empregada há muitos anos como parte do diagnóstico diferencial de azoospermia. A observação de espermatogênese anormal levaria ao diagnóstico de uma azoospermia não obstrutiva. Por outro lado, a biópsia testicular é um método eficiente na coleta de espermatozóides para a ICSI. Habitualmente o procedimento pode ser ambulatorial empregando-se anestesia local. Entretanto em algumas ocasiões o procedimento pode causar grande desconforto em pacientes mais sensíveis. As principais complicações agudas seriam o hematoma escrotal e a infecção, e a longo prazo deve-se avaliar o aparecimento de anticorpos antiespermatozóides, a fibrose e calcificações testiculares com posterior desvascularização testicular.

A TESA, é o procedimento mais indicado do que a biópsia testicular nos casos de espermatogênese normal. Em geral, as amostras colhidas por TESA contêm uma quantidade de tecido testicular suficiente para o procedimento da ICSI e subseqüente criopreservação dos espermatozóides excedentes. acreditam que em casos de espermatogênese normal não há diferença na coleta de espermatozóides executando-se TESE ou TESA. Aproximadamente 20% dos homens que procuram uma clinica de infertilidade apresentam azoospermia por falha da espermatogênese ou insuficiência testicular primária.

ASPIRAÇÃO TESTICULAR DE ESPERMATOZÓIDE (TESA)

ASPIRAÇÃO TESTICULAR DE ESPERMATOZÓIDE (TESA)


ASPIRAÇÃO PERCUTÂNEA ESPERMATOZÓIDES PRESENTES NO EPIDÍDIMO (PESA)

ASPIRAÇÃO PERCUTÂNEA ESPERMATOZÓIDES PRESENTES NO EPIDÍDIMO (PESA)

Injeção intra-citoplasmática de espermatozóide (ICSI)


A injeção intracitoplasmática de espermatozóide, é uma técnica de Fertilização in vitro, introduzida por G. Palermo et al em 1992. Como seu nome indica, a ICSI consiste na introdução mecânica de um único espermatozóide no citoplasma de cada oócito, com ajuda de um sistema de micromanipulação.

Para que esta técnica seja realizada com êxito, são necessários alguns preparos tanto no sêmen quanto no oócito.

O sêmen analisado e preparado é armazenado na incubadora até o momento da injeção.

Após a aspiração folicular, o oócito é submetido a uma série de procedimentos que antecedem à micromanipulação dos gametas. Os oócitos são então incubados em meio de cultura, por um período que pode variar de acordo com o grau de maturidade, visto que obrigatoriamente o oócito tem que estar em Metáfase da MeioseII.

Etapas do ICSI:

1° Imobilização e aspiração do espermatozóide.

ICSI

2° Posiciona-se o oócito com o corpúsculo polar na posição 12 ou 6 horas, coloca-se o espermatozóide na extremidade da micropipeta e perfura-se a zona pelúcida na linha do equador.

ICSI

3° Aspira-se cuidadosamente um pouco do citoplasma para dentro da micropipeta, para que se perceba a ruptura da membrana citoplasmática, injeta-se o espermatozóide, e retira-se a micropipeta.

ICSI

Todo esse procedimento de injeção intracitoplasmática é realizado através do micromanipulador.

Micromanipulador

Indicações:

- Fatores Masculinos:

Azoospermia: (neste caso o paciente é submetido à punção de epidídimo na tentativa de obter espermatozóides; em casos mais graves é realizada a biópsia testicular, onde é retirado fragmentos testiculares na procura de espermatozóides ou células precursoras (espermátides), para em seguida serem injetados no oócito.

Astenozoospermia: menos de 50% de espermatozóides com motilidade graus A e B.

Teratozoospermia: mais de 70% de espermatozóides com forma alterada.

- ISCA – ( Infertilidade Sem Causa Aparente )
- Falhas em ciclos de inseminação artificial e FIV convencional
- Falência Ovariana
- Pacientes submetidas a laqueadura tubária

Diagnóstico genético de pré-implantação (DGPI)


A idéia do diagnóstico genético pré-implantacional (DGPI) é anterior ao nascimento de Louise Brown, o primeiro bebê de proveta, nascida há 21 anos atrás. Essa idéia surgiu em 1960, quando o primeiro diagnóstico foi feito e quando Gardner e Edwards tentaram fazer a sexagem de embriões de coelhos em estágio de blastocisto. Entretanto, o DGPI só se tornou possível somente após a introdução da fertilização in vitro (FIV).

Os primeiros casos de DGPI foram descritos independentemente por Handyside et al. (1990) e Verlinsky et al. (1990). Handyside e seus colaboradores fizeram a biópsia embrionária em estágio de clivagem e determinaram o sexo do embrião através do uso de primers específicos para o cromossomo Y, para aqueles casos em que há um alto risco de o casal gerar crianças com doenças recessivas ligadas ao cromossomo X; enquanto Verlinsky e seus colaboradores estudaram o primeiro corpúsculo polar para se fazer o diagnóstico pré-concepcional para doenças de herança autossômica recessiva.

O Diagnóstico Genético Pré-Implantacional (DGPI) é um método realizado anteriormente ao diagnóstico pré-natal (DPN) para àqueles casais com alto risco de transmitir doenças hereditárias a seus filhos. Para que esses casais obtenham uma família saudável, a principal opção durante a gravidez é se submeter a exames de DPN, tais como amniocentese ou amostra de vilosidades coriônicas entre as 11a e 16a semanas de gravidez. Com o uso do DGPI nós fornecemos o teste diagnóstico antes da implantação do embrião no útero da paciente, evitando, assim, a possibilidade de uma interrupção de gravidez. Para pacientes portadores de anomalias cromossômicas, os casais podem passar por várias experiências de perdas gestacionais ou ao nascimento de uma criança cromossomicamente anormal.

Para o DGPI, o casal passa pela rotina de Fertilização in vitro e então os embriões com 6 a 10 células são submetidos a biópsia embrionária (3 dias após a coleta dos oócitos), 1 ou 2 células podem ser removidas e utilizadas para o diagnóstico. Após a remoção das células, o embrião é recolocado na incubadora e as células são preparadas para o diagnóstico. O procedimento de biópsia embrionária não danifica o embrião.

Figura 1: Biopsia Embrionária

Biopsia Embrionária

Biopsia Embrionária

Nós usamos a técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH) que nos permite examinar alguns cromossomos do embrião. Nós usamos essa técnica para a sexagem dos embriões para pacientes portadores de doenças ligadas ao cromossomo X, as quais afetam apenas os meninos, então somente embriões femininos serão transferidos. A técnica de FISH também pode ser utilizada para pacientes portadores de translocação balanceada ou outras anomalias cromossômicas. O diagnóstico leva entre 2 e 24 horas para ser finalizado dependendo da indicação e apenas os embriões não afetados são transferidos para o útero materno 3 ou 4 dias após a coleta dos oócitos.

Para casais portadores de um rearranjo cromossômico (translocação balanceada) ou àqueles que têm algumas células no ovário ou no testículo com um cromossomo extra (mosaicismo gonadal), há um alto risco que o feto tenha cromossomos anormais. Isso pode resultar em abortos espontâneos ou anomalias no desenvolvimento. Nas mulheres mais velhas (acima de 38 anos) há uma maior chance de gerarem uma criança portadora de anomalia cromossômica.

A gravidez é iniciada sabendo que o embrião é normal para os cromossomos analisados. Há alguns casos em que a mulher não responde bem aos medicamentos e o ciclo de tratamento pode ser cancelado antes da coleta dos oócitos. Também é possível que os oócitos não fertilizem e então, não terá embriões para transferência.

Após a biópsia e diagnóstico, algumas vezes, todos os embriões podem ser diagnosticados como afetados, e nesse caso, não terá nenhum embrião viável para transferência.

Um problema de diagnóstico ocorre quando o embrião não possui a mesma constituição cromossômica em todas as células (mosaicismo cromossômico), e então a célula que foi biopsiada pode não refletir o verdadeiro genótipo do embrião. O risco é muito baixo, mas para reduzir ainda mais esse risco, nós tentamos analisar duas células do embrião.

O DGPI é uma técnica de diagnóstico relativamente nova e ainda há um risco de erro de diagnóstico e ainda nós recomendamos que nossos pacientes se submetam ao DPN. Para doenças ligadas ao cromossomo X, basta apenas o exame de ultra-sonografia para saber o sexo do bebê.

VANTAGENS:

  • A identificação de anomalias previne a transferência de embriões que estão destinados a não implantação ou ao aborto espontâneo


  • Diminui a taxa de gravidezes trissômicas. A taxa na população geral é de 2,7%, enquanto que diminui para 1,3% nos casos submetidos ao DGPI


  • Aumenta taxa de implantação


  • Diminui taxa de abortos espontâneos

DESVANTAGENS:

  • O número de embriões viáveis para a transferência é reduzido.


  • O número de embriões que serão congelados é drasticamente reduzido. Alguns grupos de pesquisadores acreditam que afeta a viabilidade do embrião a ser congelado. Não se sabe se o dano ocorre por causa da exposição do citoesqueleto ao crioprotetor e a sacarose e/ou o procedimento da biópsia de blastômero; o formato da célula não é mantido e isso causa uma alteração na bicamada lipídica associada a glicoproteínas e ao sistema de transporte que resulta na morte celular.


  • Embora a maioria das aneuploidias seja de origem materna, a biópsia do corpúsculo polar não consegue detectar a aneuploidia paterna ou outras anomalias que ocorrem durante ou após a fertilização, tais como poliploidia, haploidia e o mosaicismo.

Embrião no estágio de 8 células

Referências Bibliográficas:

1. Handsyde et al.: Pregnancies from biopsed human preimplantaton embryos sexed by Y-specific DNA amplificaton. 1990. Nature. 344: 768-770.

2. Verlynsky et al.: Analysis of the first polar body preconception genetic diagnosis. 1990. Human Reproduction. 5:826-829.

Co-cultura ou cultura até o estágio de BLASTOCISTO


A co-cultura surgiu devido á necessidade de se conseguir in vitro o desenvolvimento dos pré-embriões até um estágio mais avançado (podendo chegar à fase de blastocisto), sem prejudicar a qualidade dos mesmos.

Baseia-se no fato de que, com a co-cultura, ocorre produção de metabólica, que atrasa o desenvolvimento embrionário, além de remover componentes tóxicos do meio de cultura.

Vários sistemas de co-cultura já foram estudados, dentre eles o realizado com células de trofoblastos, de epitélio de oviduto, com fibroblastos, com células endometriais e, atualmente, a mais utilizada é a co-cultura com Vero cells (células de rim de macaco).

Pré-embrião de 4 dias
Pré-embrião de 4 dias

Esta técnica consiste em se fazer, aproximadamente 5 dias antes da colocação dos pré-embriões, uma cultura das Vero cells até que atinjam o estado de 'monolayer'; após a observação da presença dos dois pró-núcleos, os pré-embriões scolocados juntamente com a cultura das Vero cells.

Pré-embrião de 4 dias
Pré-embrião de 6 dias

Em função da maior complexidade técnica da co-cultura, foram desenvolvidos meios de cultura capazes de promover o desenvolvimento dos pré-embriões por até 6 dias. Um exemplo disso são as figuras acima e ao lado de embriões cultivados em meio P1 (sem glicose) por 72 horas e transferidos posteriormente para o meio P2 que possibilita a permanência até o 6° dia.