Esquema do Aparelho Reprodutor Masculino:


Causas de infertilidade masculina


O fator masculino é responsável por cerca de 40% a 50% dos casos de infertilidade e deve ser prontamente solicitado ao casal uma vez que o espermograma consiste em exame simples, não invasivo e de baixo custo.

Segundo a OMS (Farley, 1987), valores normais de concentração espermática são aqueles maiores ou iguais a 20.106 espermatozóides/ml (isto é, 20 milhões de espermatozóides por mililitro ejaculado)mas, a menos que seja diagnosticada azoospermia (ausência de espermatozóides), um espermograma sub-normal tem um valor preditivo limitado, uma vez que:

Homens férteis, com dois ou mais filhos podem apresentar em determinadas ocasiões concentração inferior a 20.106 espermatozóides/ml (Rehan e cols., 1975) 3,9% de homens com oligozoospermia severa (menos de 20 milhões sptz / ml) engravidam suas parceiras em período de 5 anos e 8,7% num período de 12 anos (Schoysman e Gerris, 1982). Quanto à abstinência para a coleta, alguns autores afirmam sua necessidade desde que seja real para a frequência sexual do casal (Young, 1996). Existe consenso quanto ao número de amostras que devem ser realizadas, fixado em no mínimo dois espermogramas distanciados no tempo.O volume mínimo aceitável é de 2 ml em cada exame realizado.

A motilidade total é um parâmetro importante, uma vez que uma boa motilidade pode contribuir para a aquisição de gestação quando a concentração de espermatozóides está diminuída. Este parâmetro, quando analisado por equipamentos, pode fornecer resultados indicando motilidade até 20% menor que análises visuais. Desta forma, Simon e Laufer (1993) sugerem como normais, quando pelo menos 40% dos espermatozóides possuem movimento progressivo e rápido. Outros critérios consideram normal a presença de pelo menos 30% de espermatozóides com movimentos progressivos rápidos ou ainda quando a motilidade total é de pelo menos 50% (progressivos rápidos + progressivos lentos).

Altas porcentagens de alterações morfológicas de espermatozóides foram associadas à redução nas taxas de gravidez (McGowan e cols., 1983) devendo ser considerada normal uma análise que mostre pelo menos 30% de espermatozóides normais, ainda que tal avaliação, como a da motilidade, esteja sujeita à subjetividade. Kruger e cols. (1986), no entanto, fixaram um limite bem inferior, 14%, abaixo do qual pacientes com concentração de 20 x 106/ml e motilidade de 30% apresentaram índices baixos de fertilização in vitro.

É sabido que os leucócitos, presentes em todos os sêmens em concentrações não patológicas (1x106 /ml) são potenciais produtores de radicais livres. No entanto, como penetram no compartimento seminal somente no momento da ejaculação, seus efeitos são anulados pelos poderosos varredores presentes no plasma seminal. Quando a concentração leucocitária está acima dos valores considerados normais, o plasma seminal não é suficiente para eliminar os radicais livres gerados pelo ataque aos ácidos graxos da membrana espermática, causando alterações funcionais amplas a nível de motilidade (Aitken e cols., 1991), promovendo fosforilações de proteínas reguladoras e alterações do pH intra-celular e inibindo a reação acrossômica.

Aitken e cols. publicaram em 1991 dados de estudo prospectivo com 4 anos de seguimento mostrando uma relação inversa entre a concentração de radicais livres (medida por quimioluminescência) e a incidência de gestações espontâneas. Em 1992 Iwasaki e Gagnon mostraram que 40% dos homens inférteis apresentavam produção excessiva de radicais livres não encontrada em controles com fertilidade normal ou em azoospérmicos.

Os procedimentos de Fertilização in vitro (FIV) trouxeram melhorias significantes na compreensão do fator masculino levando a uma reconsideração completa de cada aspecto da função espermática e do processo de fertilização. Alguns pontos de vista foram reforçados como a verdadeira relevância do espermograma na avaliação da fertilidade masculina potencial e a importância do exame clínico do cônjuge deixando este de ser simplesmente o resultado de seu espermograma.

CAUSAS MAIS COMUNS DA INFERTILIDADE MASCULINA:

  • Produção ou função inadequada do sêmem
  • Anticorpos anti-espermatozóides
  • Obstrução do trato seminal
  • Criptorquia (falta de descida dos testículos)
  • Disturbios do canal de ejaculação
  • Varicocele
  • Alterações hormonais
  • Infecções
  • Fatores genéticos - Anomalias Cromossômica
  • Agressão ambiental - Radicais livres

Fatores genéticos - Microdeleções no Cromossomo Y


O papel do cromossomo Y na Infertilidade Masculina

A disponibilidade e o amplo uso das técnicas de reprodução assistida estão em contraste com o progresso lento no sentido da compreensão da etiologia das várias formas de infertilidade humana. Isto é particularmente verdade para a infertilidade masculina. Recentemente, pesquisa básica utilizando as aplicações da moderna biologia molecular em uma variedade de modelos experimentais em mamíferos e não mamíferos estão começando a elucidar alguns dos mecanismos responsáveis pela espermatogênese, espermiogênese e função espermática. Um desses exemplos é a aplicação do rastreamento do cromossomo Y para detecção de microdeleções no braço longo (Yq), mais precisamente na região 11.23 (Yq11.23).

Uma ampla gama de defeitos na espermatogênese, indo da Síndrome de Células de Sertoli exclusivas ao bloqueio de maturação espermática ou hipoespermatogênese têm sido associadas à essas microdeleções em regiões variadas de Yq, numa área conhecida como AZF (Azoospermic Factor).

A identidade molecular de AZF ainda é desconhecida mas um dos genes-candidato mais forte para ocupar o locus responsável pela espermatogênese parece ser DAZ (deletado na azoospermia), uma sequência consistentemente faltante em aproximadamente 14% dos homens azoospérmicos e em aproximadamente 10% dos oligospérmicos severos. Outras regiões também têm sido descritas como cadidatas em potencial ao gene da espermatogênese: a RBM1 e RBM2 (RNA binding mitif) e as regiões AZFa, AZFb e AZFc. A função predita das proteínas codificadas por essas regiões é a ligação ao RNA ou ao DNA de fita simples com a finalidade de regulação pós-transcripcional da expressão gênica.

A Procura do Fator de Azoospermia - AZF

Homens com deleção em DAZ podem produzir espermatozóides, ainda que em menor número e esses espermatozóides podem ser utilizados para ICSI. Gestações provenientes desses casos têm sido referidas na literatura. Uma vez que os espermatozóides contendo o cromossomo Y portador da mesma deleção presente no sangue periférico podem ter sido utilizados para a ICSI resultando em gestação e nascimento, se a o produto for um recém-nascido do sexo masculino, ele também será portador da mesma deleção e, consequentemente, do mesmo quadro clínico de azoospermia ou oligospermia severa. Assim, é muito provável que ocorra uma transmissão da infertilidade masculina de pai para filho.

Novos Exames

Testes genéticos para rastreamento de microdeleções nas regiões do cromossomo Y possivelmente relacionadas à infertilidade masculina são no presente, recomendáveis e aconselhamento genético para todos os homens inférteis com azoos ou oligospermia antes da aplicação das técnicas de R.A. são hoje uma realidade nos países do primeiro mundo.

Acredita-se que cerca de 15 a 20% dos casais tenha algum tipo de dificuldade para engravidar, necessitando de auxílio através de técnicas de reprodução assistida. Ao contrário do que se acreditava antigamente, no entanto, em metade desse casais o fator de infertilidade é masculino. Esses homens têm um amplo espectro de problemas na função gonadal que inclui azoospermia ou oligospermia com ou sem astenospermia e/ou teratospermia associadas.

A despeito da disponibilidade de inúmeros testes andrológicos para identificação da etiologia da afecção, em cerca de 50% desses homens não se pode encontrar uma explicação causal, passando a ser classificados como homens com infertilidade idiopática.

O desconhecimento da etiologia levou a um progresso pífio no sentido do desenvolvimento de terapias de correção ou melhora de quadros de oligo/asteno e/ou teratozoospermia, com resultados desalentadores e ineficientes. Em contrapartida, as técnicas de reprodução assistida, especialmente a injeção intra-citoplasmática de espermatozóides (ICSI) revolucionaram a abordagem do homem infértil, dando a eles possibilidade concreta de transpor o problema clínico e constituir sua própria família.

Como realizar o teste para pesquisa de microdeleções no Cromossomo Y


1. Cuidados na coleta

Exame é simples. Para o paciente consiste na retirada de 15 ml de sangue que deve ser colhido em EDTA ou em tubo Vacuntainer de tampa roxa.

O sangue deverá ser encaminhado preferencialmente às segundas e terças feiras.

O sangue coletado deve ser encaminhado o mais rapidamente possível, no próprio tubo de tampa roxa, em isopor com bolsa de gelo para manter o sangue resfriado.

Na impossibilidade do sangue ser encaminhado imediatamente, ele poderá permanecer na geladeira. Essa permanência não deve ser superior à 36 horas.

Em casos imprevistos, o sangue poderá ser congelado. porém, deverá ser encaminhado também congelado porque uma vez descongelado o sangue deve ser processado imediatamente.

2. O exame

A primeira etapa do teste é a extração do DNA contido nas células presentes no sangue. Após a extração do DNA ele é quantificado em gel de quantificação (que nos dá a concentração de DNA presente na amostra de sangue coletado). Após a quantificação o DNA é submetido à espectrofotometria, que avalia sua pureza. Caso o resultado indique presença de excesso de proteínas ou sais, a amostra deverá sofrer uma purificação.

Após a purificação o DNA é diluído para a concentração adequada a ser utilizada na reação em cadeia da polimerase - PCR.

2.1. O PCR

A Reação em Cadeia da Polimerase - PCR, é uma técnica para amplificação in vitro de sequências específicas de DNA, sistematizada e denominada por Mullis e seus colaboradores em 1987, o que lhe valeu o Prêmio Nobel.

A técnica consiste na síntese simultânea de fitas complementares de DNA alvo que é localizado por um par de primers. O primer é um pequeno segmento de DNA complementar à região do DNA que se deseja investigar a presença num determinado indivíduo. A reação é montada colocando-se em um tubo plástico o DNA do paciente, os primers específicos, uma enzima especial, a Polimerase, que faz a síntese da fita complementar ao DNA alvo e os recursos para que a síntese tenha êxito, que são os nucleotídeos (cada uma das 4 unidades básicas de composição do DNA).

O tubo plástico é então colocado em uma máquina denominada Termociclador que promove ciclos de aquecimento e resfriamento ao fim dos quais um grande número de cópias de DNA alvo é produzida. Em uma reação típica de PCR, o DNA dupla-fita (do paciente no caso) é denaturado por um rápido aquecimento à 90-95ºC (30 segundos a 1 minuto) seguido por breve resfriamento a 40-60ºC que permite o anelamento dos primers ao DNA alvo ao qual são complementares, seguido de novo aquecimento a 70-75ºC para que a extensão possa ocorrer, isto é, para que a síntese da cadeia complementar ao DNA alvo possa ser realizada com auxílio da enzima Taq polimerase. O resultado é a produção de um grande número de cópias do DNA alvo, com um tamanho específico em quantidade de pares de base.

A última etapa é a vizualização do produto de amplificação, possível através de eletroforese em gel de agarose, coloração do gel, vizualização com luz de ultra violeta e registro fotográfico.

A interpretação do resultado é simples, e consiste na presença ou não de uma banda no gel, na altura correspondente ao número de pares de base esperado para o fragmento que foi amplificado: quando a banda está presente, significa que o paciente possui aquele segmento de DNA, quando a banda não está presente, significa que o paciente não possui aquele segmento de DNA (deleção), ou o segmento está alterado não permitindo que o primer encontre seu alvo (mutação) ou a reação não foi realizada em condições ideais, devendo ser repetida. Para que possamos afirmar que um paciente não amplifica uma determinada região, deve-se repetir a mesma reação 3 vezes e em todas o produto deve estar ausente.

A Reação em Cadeia da Polimerase é um exame que visa a amplificação.

Reação em Cadeia da Polimerase

DAZ

sy 129

P1= sy129-

Note que na 1ª coluna não apareceu a banda branca correspondente do produto da amplificação utilizando o primer sy129.